Ruptura celular, extração e encapsulamento de Astaxantina de Haematococcus pluvialis (Volvocales, Chlorophyta)

O interesse na produção de astaxantina de fontes naturais vem aumentando significativamente, devido principalmente à sua capacidade como potente agente antioxidante. Na obtenção da astaxantina por via biotecnológica, a microalga Haematococcus pluvialis é um dos micro-organismos industrialmente mais interessantes. Entretanto, como a maioria dos carotenoides, a astaxantina é uma molécula altamente insaturada que pode ser facilmente degradada por processos térmicos. Em função desta instabilidade, uma possibilidade que se abre, a fim de proteger sua atividade biológica de fatores ambientais e reforçar a sua estabilidade física, é o encapsulamento. Neste sentido, este trabalho vem contribuir em inovações relacionadas ao desenvolvimento de tecnologia para ruptura celular, extração e nanoencapsulamento de astaxantina produzida por via biotecnológica, mais especificamente de astaxantina obtida através do cultivo de H. pluvialis. Neste estudo, os cultivos foram realizados em meio BBM e acetato de sódio e conduzidos a temperatura constante de 25±1 ºC em fotobiorreatores de 1 L com aeração por borbulhamento de ar de 300 mL.min-1 , agitação manual diária e sob iluminância constante de 444 µmol fótons.m-2 s -1 durante 15 dias, sendo inoculados com suspensão de microalgas previamente preparada, na proporção de 10%, e pH ajustado em 7,0. A biomassa foi recuperada dos cultivos por centrifugação e seca a 35 °C por 48 h. Em seguida, foram empregadas diferentes técnicas de ruptura celular (química, mecânica e enzimática). Após a ruptura, foi realizada a extração dos carotenoides e a quantificação dos carotenoides totais (µg.g-1 ) e da extratibilidade (%). Entre os solventes testados no método de ruptura química, o diclorometano foi o selecionado para a extração dos pigmentos carotenoides. Dentre as técnicas mecânicas de ruptura celular, a maceração da biomassa congelada com terra diatomácea resultou na maior extratibilidade e carotenoides totais (66,01% e 972,35 μg.g-1 ). A melhor condição de lise da parede celular de H. pluvialis, utilizando o preparado enzimático Glucanex® , ocorreu em pH do meio reacional de 4,5 a 55 ºC, com atividade inicial de β-1,3-glucanase de 0,6 U.mL-1 e um tempo de reação de 30 min, alcançando-se 17,73% de atividade lítica relativa. Nestas condições, com a reação enzimática assistida por ultrassom sem congelamento prévio da biomassa, atingiu-se 83,90% e 1235,89 µg.g -1 , respectivamente, para extratibilidade e carotenoides totais. Dentre as técnicas combinadas testadas, a maceração com terra diatomácea associada à lise enzimática apresentou valores de extratibilidade e carotenoides totais de, respectivamente, 93,83% e 1382,12 µg.g-1 . No encapsulamento do extrato contendo astaxantina obtido por lise enzimática associada por ultrassom, envolvendo a coprecipitação com PHBV (poli(3-hidroxibutirato-cohidroxivalerato)) em fluidos supercríticos, o aumento da pressão tendeu a reduzir o diâmetro da partícula formada, enquanto que o aumento da relação biomassa contendo astaxantina:diclorometano usada na etapa de extração incrementou o percentual de encapsulamento e a eficiência de encapsulamento para ambas pressões testadas (80 e 100 bar). Os maiores valores de percentual de encapsulamento (17,06%) e eficiência de encapsulamento (51,21%) foram obtidos nas condições de 80 bar e relação biomassa:diclorometano de 10 mg.mL -1 . Nestas condições, o diâmetro médio de partícula foi de 0,228 µm. Com base nos resultados obtidos, técnicas para a obtenção de astaxantina de H. pluvialis e seu encapsulamento foram desenvolvidas com sucesso, podendo ser extendidas a outros produtos intracelulares de microalgas.

Otimização e validação de métodos empregando DLLME, SPE, HPLC-DAD e LC-ESI-MS/MS para determinação de agrotóxicos em água subterrânea

A preocupação com a poluição das águas por agrotóxicos tem aumentado, visto que aumentou o número de detecções de agrotóxicos em águas. A falta de avaliação da qualidade da água consumida pela população de áreas rurais onde não existe o abastecimento público de água potável, deve ser considerada, pois essas águas se encontram próximo a áreas de cultivo, onde há intensa aplicação de agrotóxicos. Nessas regiões, o abastecimento de água para as residências e para a irrigação é feito geralmente através das águas de poços. Neste trabalho, um método para determinação dos agrotóxicos carbofurano, clomazona, 2,4-D e tebuconazol em água subterrânea foi desenvolvido e validado. O método utilizou a Extração em Fase Sólida (SPE) e determinação por Cromatografia Líquida de Alta eficiência com Detecção por Arranjo de Diodos (HPLC-DAD) e confirmação por Cromatografia Líquida tandem Espectrometria de Massas (LC-MS/MS). Para a SPE utilizou-se cartuchos C18 de 200 mg, e eluição com 1 mL de metanol. Após a otimização dos parâmetros de extração e separação dos compostos, o método foi validado avaliando-se curva analítica, linearidade, limites de detecção e quantificação, precisão (repetitividade e precisão intermediária) e exatidão (recuperação). Todas as curvas analíticas apresentaram valores de r maiores que 0,99. Os LOQs para o método, considerando a etapa de pré-concentração de 250 vezes, foram de 0,2 µg L -1 para todos os agrotóxicos por HPLC-DAD e, por LC-MS/MS, 4,0 ng L -1 para clomazona, carbofurano e tebuconazol e de 40,0 ng L -1 para 2,4-D. As recuperações foram entre 60,3 e 107,7% para a repetitividade e entre 67,5 e 115,3% para a precisão intermediária, com RSD de 0,8 a 20,7% para todos os compostos por HPLC-DAD. Para o LC-MS/MS a precisão em termos de repetitividade, variou entre 0,97 e 20,7%, e as recuperações entre 67,0 e 108,9%. O método foi aplicado na determinação de agrotóxicos em amostras de águas subterrâneas durante um ano. Nas amostras foram detectados agrotóxicos em níveis de µg L -1 . Dentro do contexto atual da Química Analítica, de desenvolver métodos mais rápidos, que utilizem menor quantidade de solvente, de amostra e com altos fatores de enriquecimento, foi otimizado um método de extração para os agrotóxicos carbofurano, clomazona e tebuconazol utilizando a Microextração Líquido-Líquido Dispersiva (DLLME) e determinação por LC-MS/MS. Foram otimizados alguns parâmetros que influenciam no processo de extração, como: tipo e volume dos solventes dispersores e extratores, tempo de extração, força iônica e velocidade de centrifugação. Nas condições otimizadas, as recuperações para os níveis de concentração entre 0,02 e 2,0 g L -1 variaram entre 62,7 e 120,0%, com valores de RSD entre 1,9 e 9,1%. O LOQ do método foi de 0,02 µg L -1 para todos os compostos. Quando comparado com a SPE se demonstrou rápido, simples, de baixo custo, além de necessitar de menores volumes de amostra para determinação de agrotóxicos em águas. O método mostrou-se adequado à análise dos agrotóxicos em água subterrânea e todos os parâmetros de validação obtidos estão dentro dos limites sugeridos para validação de métodos cromatográficos